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0000000000000002024年国家自然科学基金项目申请集中接收期间,国家自然科学基金委员会(以下简称自然科学基金委)共接收项目申请384564项,经初审和复审后共受理383126项。根据《国家自然科学基金条例》、国家自然科学基金相关项目管理办法和专家评审意见,经自然科学基金委委务会议审批,资助面上项目20758项、重点项目745项、重点国际(地区)合作研究项目87项、青年科学基金项目23226项、优秀青年科学基金项目654项、国家杰出青年科学基金项目433项、创新000流式细胞技术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种高效的方法,用于分析和收集细胞悬液中的单个细胞。FCM的优势在于其速度快、结果客观,并且具有重要的统计意义。它能够处理复杂的样本,同时收集多个参数,其可靠性和重复性都非常出色。 今天我将总结并分享一系列关于流式细胞技术的常见问题及其分析。对于流式细胞术的原理和步骤不甚清晰的同学,建议先阅读本公众号以往的文章,了解背景知识。 1.荧光抗体染色无信号或信号弱 (1)加入的抗0000000000引物合成和基因合成是两种不同的技术,它们在合成长度上的差异主要是由于它们各自采用的化学合成方法和应用目的不同。引物合成: 引物通常是短的单链DNA片段,长度一般在15-30个碱基对(bp)之间。 引物合成通常采用固相合成技术,通过逐个添加碱基的方式构建序列。 当引物长度超过200bp时,合成的难度和成本会显著增加,因为固相合成的准确性会随着序列的延长而降低,同时,合成过程中的副反应和杂质积累也会增加。基因合成: 基因合成0逆转录常见问题与解决办法: 1.可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗? 不可以。逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。 2.如何检测RNA逆转录成功与否? 1) 内参法:理论上,逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段,所以电泳条带应该均匀分布在泳道上,如果RNA丰度低,电泳检测也可能无产物,这种情况通过PCR扩0在分子生物学中,有许多常用的PCR引物设计软件,这些软件可以帮助研究人员设计特异性的引物,以便在PCR反应中准确地扩增目标DNA片段。以下是一些常用的PCR引物设计软件:1. Primer-BLAST: - 这是美国国立卫生研究院(NIH)开发的一个在线工具,用于设计引物并对引物的特异性进行评估。它可以根据用户提供的序列设计引物,并检查引物与非目标序列的互补性。2. Primer3: - Primer3是一个广泛使用的引物设计软件,它可以根据用户指定的参数设计引物,0TAE和TBE TAE缓冲液 实验之中经常将TAE配制成10× 或者 50× 的储液,实验前稀释储液到1×的工作液。1x TAE 缓冲液的成分是: 40 mM Tris (pH 7.6) 20 mM acetic acid 1 mM EDTA 50x TAE储液配制方法: 将Tris(FW=121) 242g,100 ml 0.5 M EDTA, 57.1 ml的冰醋酸溶解在600 ml的去离子水中;而后调节pH至8.3,加去离子水定容至1L后,室温保存。 使用时稀释50倍 即1×TAE Buffer TBE缓冲液 TBE缓冲液可以配置成 5× or 10×的储液。1x TBE 缓冲液的成分是: 89 mM Tris (pH 7.6) 89 mM boric acid 2 mM EDTA 10x TBE 储0苏木精-伊红染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining ),简称HE染色法 ,切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。 实验步骤: 1、取样固定 取新鲜的组织样品,加入4 %多聚甲醛组织固定液的EP管中。取样材料应该小而薄,约黄豆粒大小。 2、脱水 采用梯度酒精浓度法脱水。通常选择50%-60%-70%-90%-95%-100%的浓度梯度,各酒精浓度要求准确,95%0在培养贴壁细胞的时候,偶尔会出现细胞接种后贴壁不均匀的情况。有的地方长得非常密集,有的地方却太稀疏。虽然这对于常规培养并不算大问题,但有时则可能影响后续的实验进程。 所以一旦遇到贴壁不匀,建议排查原因并优化操作方案。 本文中将细胞贴壁不均匀总结归纳为四种情况: 局部生长密集,密集处呈不规则分布 原因:一般是接种时没有混匀,或者细胞传代时没有消化彻底从而形成细胞团块导致的 解决方案:继续培养1-2天,待细胞状0原 位 杂 交 组 织 ( 或 细 胞 ) 化 学 (In situ Hybridization Histochemistry , ISHH) 简 称 原 位 杂 交 (In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的 DNA 或 RNA 为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。 一、合成RNA探针 1、设计探针引物 RNA探针长度500bp最为合适。一轮引物不添加启动子序列,二轮引物在正向引物的5端加上T7启动子序列,在反向引物的5端加上SP6启动子序列。 2、探针合成 用未添加启动子序列的引物克隆出探针序列的DNA模00免疫印迹(Western blot, WB)是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。WB除了能证明某样品中含有某种蛋白之外,其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平,前提条件就是等量的上样量,以确保目标蛋白变化具有可比性。内参的意义就是保证上样量的一致。 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体0是不是非特异带? “出现杂带”以及“条带位置不符合预期”,这两种情况需要分开讨论: 第一种情况:蛋白转录及翻译后的修饰,该因素是引起杂带的最常见原因。转录后,由于选择性剪切的作用,同一个转录本会翻译出不同大小的蛋白,这类蛋白称为该蛋白的剪接体。在UniProt查询蛋白时,可以在“Sequences ”部分看到该蛋白已报道过的Isoforms。在进行实验前,需要比对每个剪接体造成的变化是否影响了目标蛋白的对应结构域,进而 判断本研究种0000"铁死亡"(Ferroptosis)最近几年一直是科研界的焦点,其研究热度只增不减。对于这一细胞死亡方式的检测指标,你或许还不太熟悉,不用担心,我们已经为你整理了一份详尽的清单。 1 细胞活性检测:铁死亡会导致细胞活力下降,可以通过MTT、CCK-8等细胞活性实验来评估。 2 脂质过氧化物:铁死亡的一个关键特征是脂质过氧化的积累,可以通过检测丙二醛(MDA)和脂质过氧化产物(LPO)来衡量。 3 二价铁离子:细胞内的亚铁离子(Fe²⁺)积累0实验室中常常使用的各类溶液种类繁多,且配制方法五花八门,是否挑花眼了呢?本文总结了近三十种常用溶液、缓冲液、培养基的配制方法,涵盖了分子生物学、蛋白分析、细胞培养、微生物培养等各个领域。 核酸电泳之 TBE、TAE 和 MOPS 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷(Tris)是一种应用非常广泛的有机试剂。它及其衍生物被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备,可用于制作药物、有机合成、生物缓冲剂等。 用途:可以用于进行试剂的配制000000载体 在Cohen和Boyer的实验中,两种质粒都能在E. coli中复制。因此,这两种质粒都可以作为载体,使重组DNA得以复制。所有基因克隆实验都需要这样的载体,我们称之为载体(Vector),但典型的基因克隆实验只涉及一个载体,以及一个依赖于载体进行复制的外源DNA片段。外源DNA没有复制起点,即DNA复制开始的地方,因此除非将其放入具有复制起点的载体中,否则它无法复制。自20世纪70年代中期以来,已经开发了许多载体;这些载体分为两大类:质粒(pl0在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不