为什么前五个孔道这么浅啊

出转印膜，nc和pvdf的 性价比高高滴

杂带过多，且背景脏。上样量10ug，电泳条件80V转到120V，86min；转膜条件：200mA 60min，封闭液是5%的牛奶，reuse的封闭30min；一抗调整了比例1/10000，4℃过夜；TBST，10min，洗三次；二抗1/50000，室温30min，TBST洗一次，10min

跑的是一个蛋白分子量135的整联蛋白 integrin αV，一抗稀释浓度1：1000.TBST洗膜三次十分钟都是，牛奶封闭俩小时，二抗1;10000。感觉步骤没有问题啊。各位大佬帮忙想想法子

1、转膜不充分 (1)膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol浸透膜。 (2)靶蛋白分子量小于10 000 选择小孔径的膜，缩短转移时间。 (3)靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。 (4)甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。 (5)转移时间不够 对于厚的胶

1、PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 2、热启动PCR 常规PCR的扩增开始时间并不是放进PCR仪，运转程序才开始扩增。当体系配置完成的时候，扩增就开始了，这可能会引起非特异性扩增出现，热启动PCR可

在蛋白质比色定量试验中，最常用的方法是二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量。那么为什么我们要选择用BCA法？BCA法是Lowry测定法的一种改进方法，与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 BCA法蛋白定量的原理是什么？ 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量，

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相比于预制的梯度凝胶，在自制的固定浓度凝胶中，预染蛋白质分子量标准的条带会看起来显得略粗一些，而不如前者锐利。当条带较粗的时候，我们的实践经验显示，分子量的参考一般应以条带的上半部为准。 有些小伙伴的WB结果参照蛋白Marker，与预期大小不符，第一反应就是Marker不准。那么除了我们之前分析的预染蛋白Marker本身的准确性的问题，还有没有其他原因呢？ SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离，是蛋白在充分变性、还原条件下，

预染蛋白Marker，染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样，其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间，不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中，染料标记效率的波动将直接影响到最终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此，标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数，仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是，染料标记的蛋白质产物的分子

预染蛋白Marker，又分单色预染Marker、双色预染Marker，多色预染Marker。如图： 单色预染蛋白Marker通常会加深某些条带的粗细，方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色，更加方便记忆区分。 除了上面介绍的，市面上还有一些其他类型的蛋白Marker：如显影蛋白Marker等。 显影蛋白Marker，蛋白条带中含有lgG结合位点，lgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。

目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker。 *非预染蛋白Marke 是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以最准确。 *预染蛋白Marker 是纯化好的几种蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一

western blot蛋白凝胶电泳 在一个固定的点缓慢地加入胶，在胶凝固之前不要移动位置。加交叉梳子不要有气泡，然后加入蛋白样品，盖上盖子检查正负极，恒压100v大约跑90分钟，提前用1*Buffer浸泡NC膜，胶泡好后，小心的撬开玻璃板，把多余的胶切掉，三明治的顺序是黑色一面-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-白色一面，插入清洗过的电泳槽，倒入1*Buffer，倒入百分之五脱脂奶粉封闭一小时，（一抗孵育），将膜放入自封袋中，加入抗体，4度过夜，室温摇床

箭头指向的位置，背景已经脱色干净后，这里依然有颜色。而且条带跑的号丑，也不知道怎么用全自动凝胶在像系统拍照

Western blot结果常见问题分析 蛋白免疫印迹(western blot,即WB),想必做蛋白相关实验的小伙伴们都很熟悉,这里就不过多赘述了,但是做起实验并没那么容易。每当我们准备好样本,满怀希望自己可以做出这样的实验结果时: 结果却只能得到这样 还有这样,目的条带傻傻分不清 甚至是这样的 面对这些残忍的现实时,我们该怎么抉择?重复一次?换个蛋白?换个抗体?显然这些方案都不是更佳的方案。 为了避免出现以上问题,现在就给大家梳理一下western blot中常见问题以

蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 蛋白实验虽然简单，但是条带容易出现的问题极多，下面来分享一下不同条带的原因和解决办法吧。 出现不均匀的白色斑点的原因 转膜时有气泡 膜上抗体分布不均匀 解决办法 转膜前小心去除气泡 抗体

重提了蛋白、降低了一抗、二抗浓度都没用，还是没有条带

离谱，想要表达的蛋白不表达，不想让他表达的他表达量贼啦高。我觉得我要没了

分离胶凝固的时候出现的这种水滴状，好多次了，加水很缓慢了还是会有，这种跑出来就是弯的，脑袋很疼

SILAC ( Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)技术是利用哺乳动物细胞增殖对必需氨基酸的依赖性原理而设计的代谢标记蛋白质的方法。SILAC技术应用于定量蛋白质组研究,为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案,是目前最先进的、进行细胞中蛋白质相互作用和蛋白质表达差异的定量蛋白质组学技术。 技术特点 1、高效性:SILAC是体内标记技术,标记效率可高达100%; 2、定量精确,线性范围广,降低由于样品制备、实验

关于SDS-PAGE 蛋白电泳的常见问题分析 1. 关于凝胶的一些问题 1. 胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大 TEMED 和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。 2. 胶不凝，解决方法：温度较低时加大 TEMED 和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。 3. 胶易碎，例如浓度较高的胶

代做western blot,加q1628784735

为什么样品冻融几次会出现特异性条带？而且mock也出现，挺整齐的，比目的条带小一些，这个原理是什么？好困惑

western第一次曝光没经验，底片不清晰，但是最上面有黑色的，是目的蛋白吗？第二张是漂洗一次后重新曝光，底色清楚，可是条带杂，第三张是第三次曝光，差别好大。求大神们帮忙解答下，第一次做，好焦虑呀

求问大佬，右边这种尾部晕开是为什么呢，而且条带跑着增宽了，左边把右边的压缩了是为什么嗯 左边是COIP后的样，右边是培养基浓缩的样品

hello大家好，我在加拿大多伦多留学+工作已经有7年了，我在国内就读国际学校，高三出国，于2017年在western读完了degree。希望可以力所能及的帮到各位曾经跟我一样的留学生👩🎓👩🎓。我了解这边高中/college/大学的制度、学校、还有生活，有想初中、高中、大学出国留学转校的有任何问题和需要都可以留言

本人最近做膜蛋白的WB实验，用THERMO的膜蛋白提取试剂盒提取的细胞膜蛋白。之前用的abbkine的NA/K ATP 酶抗体当内参，但是做出来的内参条带非常浅，不好观察。求大神推荐好用实惠的A/K ATP内参，或者其他膜蛋白内参~~~方便的话，能提供下该内参使用的相关文献吗？

经核实吧主居心叵测L 未通过普通吧主考核。违反《百度贴吧吧主制度》第八章规定http://tieba.baidu.com/tb/system.html#cnt08 ，无法在建设 western吧 内容上、言论导向上发挥应有的模范带头作用。故撤销其吧主管理权限。百度贴吧管理组

老板们，想买个如图的配胶的槽子，大家有知道哪个公司有卖吗？？

生物化学方法根据靶点的不同一般可以分为4种，以酶为靶点、以受体为靶点、以离子通道为靶点、以核酸为靶点。 以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。 筛选作用于酶的药物, 主要是观察药物对酶活性的影响, 由于药物与酶的相互作用也是分子间的结合, 也可以采用与靶点结合的方法进行检测。但是要根据酶的特点来决定。检测酶活性的

第一部分 WB操作中需要注意事项 一、蛋白样品的准备 1、样品质量 所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB 一般5×106就足够 3、小分子量蛋白10KD需要的注意点 1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系 2

一、实验原理 Western Blot 蛋白免疫印迹，是利用抗原抗体免疫反应检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。 Western Blot 的检测对象为游离蛋白，根据实验需求可以按组分不同分为总蛋白，浆蛋白，核蛋白，线粒体蛋白和膜蛋白等。 二、实验流程

乳酸菌表面展示目的蛋白，western一直没有目的条带，曝光时间短看不见目的条带，曝光时间长，膜的背景就会发黑。间接免疫荧光有荧光，流式也有，western一直做不出来，大仙们有遇到这样的情况吗

产品介绍 用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。 超300家实验室应用3年，从未想过更换！ 主要特点 Pg级别 EnlightTM-Plus含高灵敏的发光增强剂，检测级别可以达到pg级。 低背景 EnlightTM-Plus采用精准的发光底物，有效降低发光试剂造成的非特异发光和背景发光。 时间长 EnlightTM-Plus采用特异的发光配方，发光时间非常长，有效从容实验。 应用于本产品发表的部分文献 1.Nature Communications. 2016 Mar 31. Zyxin-Siah2–Lats2 axis mediates cooperation between Hippo and TGF

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Knowing so much thing.Which western country I haven't been ?

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生，经常有朋友反映，加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光，可亮光很快就消逝了，压完片后，条带却很弱，甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么？ 要解释这种情况发生的原因，必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2体系中扮演着核心角色，决定着

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充分，封闭不充分等都可以造成抗体在膜上的非特异结合，制造背景；转移膜包括最后曝光时

我做western实验时，小鼠其他各个组织中能检测到GAPDH，只有小鼠的精细胞中没有？难道小鼠精细胞不能用GAPDH做内参，请高手指点，谢谢！纠结了好久了

我做western时，小鼠的精细胞中没有GAPDH条带

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